动物细胞工程专题复习 常州市第三中学 陈 磊 资料一：犬细小病毒是1978年澳大利亚的Kelly和加拿大的Thomson等同时从患肠炎的病犬粪便中分离获得的，世界各地均有流行，是危害犬类的最主要的烈性传染病之一。该病毒主要感染幼犬，传染性极强，死亡率极高。 资料二：大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：①体外培养法，可获得10μg/mL的抗体；②动物体内诱生法可获得5~20mg/mL的抗体。 资料三：科学家从某些能无限增殖的细胞的细胞质中分离出无限增殖调控基因（prG），该基因能激发许多动物细胞的分裂，这为单克隆抗体的制备提供了更为广阔的前景。 资料四：犬细小病毒单克隆抗体（CPV McAb）可快速准确的识别犬细小病毒并与犬细小抗原结合形成抗原抗体复合物。从而能够用于快速筛查犬粪便中的犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV） 。 资料五：肺癌在全国的发病率居肿瘤之首，小细胞肺癌是恶性程度最高的一种，上海肺瘤研究所细胞与分子免疫研究室在国内率先研制出一种名叫“2F7”的靶向生物导弹。这种生物导弹是一种专门对小细胞肺癌产生特定靶向性的特异性单克隆抗体。注入静脉后，会“直扑”小细胞肺癌病灶，使其携带的肿瘤化疗药物能“集中火力”抑制、杀灭肿瘤细胞。这预示着化疗药物有望弥补“良莠不分”、损害全身免疫力的缺陷。 一．单克隆抗体 1.制备过程： 2.单克隆抗体的特点： 3.单克隆抗体的应用： 思考：如何检查小狗体内有无犬细小病毒？ 思考： 1．已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。 请回答： （1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。 （2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并简述原理。 方法： 。 2.现将从预先注射了某种抗原的小鼠脾脏中获得的B淋巴细胞与上述骨髓瘤细胞混合，加入PEG促融后，再加入含氨基嘌呤的培养液。若将这些混合物分装于细胞培养板的小孔中培养（如右图所示），则小孔中的培养物不可能出现的结果是 A．细胞分裂繁殖，产生抗体，专一性抗体检验呈阴性 B．细胞分裂繁殖，产生抗体，专一性抗体检验呈阳性 C．没有活细胞，产生抗体 D．没有活细胞，不产生抗体 二．动物细胞融合 1.概念： 2.动物细胞融合基本原理： 3.诱导方法： 4.过程 三．动物细胞培养 1.原理： 2.过程： 3.条件： 四．核移植技术 1.过程：（以多莉为例） 2.原理： 思考：根据资料三思考一下，能不能通过其他途径获得单克隆抗体？ 反馈练习： 1. 某小鼠的癌细胞具有氯霉素抗性，通过细胞核移植技术，将无氯霉素抗性的小鼠体细胞核取出，注入去核的小鼠癌细胞中，然后将这一重组细胞培养在含有氯霉素的培养基中，结果发现，该重组细胞不能分裂生长。这一实验可以说明 A. 该重组细胞具有氯霉素抗性 B. 氯霉素抗性属于细胞核遗传 C. 该重组细胞可称为细胞株 D. 核移植过程中核基因发生了突变 2.下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是 A．培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清 B．原代培养的细胞一般传至10代左右便会出现生长停滞 C．动物细胞培养一般能够传到40～50代，但其遗传物质发生了改变 D．动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量自身健康细胞 3.右下图是某动物细胞培养时,培养液中活细胞和死亡细胞密度统计结果。相关叙述正确的是 A. 培养第6 d时,新产生的细胞数等于死亡细胞数 B. 培养液中应适当加入青霉素、链霉素,以避免杂菌污染 C. 曲线bc段产生的主要原因是培养液中营养物质不足及有 害代谢产物积累等 D. 实验中要控制胰蛋白酶溶液浓度和处理时间,以免损伤细胞 4. 科学研究发现:用人的体细胞与小鼠体细胞进行融合得到的杂种细胞,在持续分裂过程中鼠的染色体能得以保留而人类染色体则会逐渐丢失,最后只剩一条或几条。下页图表示人的缺乏HGPRT酶突变细胞株(HGPRT-)和小鼠的缺乏TK酶细胞株(TK-)融合后并在HAT培养液中培养的过程,结果表明最终人的染色体在融合细胞中仅存有3号染色体或17号染色体或两者都有。已知只有同时具有HGPRT酶和TK酶的融合细胞才可在HAT培养液中长期存活与繁殖。下列相关叙述正确的是 A. 从培养过程看,HAT培养液只是为了筛选杂种细胞 B. 从图示结果看,可以确定人的TK酶基因位于17号染色体 C. 该方法可以对鼠基因定位,小鼠的HGPRT酶位于3号染 色体 D. 过程②中为了防止细菌的污染,所用培养液应该添加一 定量的干扰素 5. 下图为单克隆抗体制备流程示意图。 （1）单克隆抗体制备技术的基础是 。 （2）细胞融合是随机的过程，在HAT培养基中培养，目的是 。在细胞培养过程中，培养液中需要添加无机盐，但要注意无机盐的 ，以保证生命活动的正常进行。 （3）为选育出能产生高特异性抗体的细胞，要将从HAT培养基上筛选出的细胞稀释到7～10个细胞／ml，每孔滴入0.1ml细胞稀释液，其目的是 。 （4）若用15N标记的氨基酸培养能产生单克隆抗体的细胞，放射性物质在细胞结构中出现的先后顺序是 。 6. 现有甲、乙两种可能有一定毒性的化学物质，实验室研究人员欲通过动物细胞培养的方法来鉴定它们是否有毒性并比较二者毒性的高低。请你以一个研究人员的身份参与此项研究，完成下列有关试验： 试验原理：有毒物质会使动物细胞发生染色体变异，根据这种变异细胞占全部培养细胞的 百分数（一下称Q值），可判断该化学物质的毒性的高低。 材料用具：活的小白鼠胚胎、胰蛋白酶液、动物细胞培养液、动物细胞固定液、适宜浓度 的龙胆紫溶液、适宜浓度的化学物质甲溶液、适宜浓度的化学物质乙溶液、蒸馏水、滴管、 培养皿、剪刀、锥形瓶、恒温箱、载玻片、盖玻片、显微镜、小白鼠正常有丝分裂各时期 的高倍显微镜照片。 试验步骤： （1）制备细胞悬浮液： 把活的小白鼠胚胎放在培养皿中剪碎，转入锥形瓶中，加入 液处理，使胚 胎组织离散成单个细胞，再加入动物细胞培养液，制成细胞悬浮液。 （2）进行细胞培养，观察甲、乙两种物质的毒性有无及高低： ①取3个洁净的培养瓶，编号A、B、C，然后依次加入 。 ②向A、B两个培养瓶中分别加入等量的适宜浓度的甲、乙溶液，C瓶中加入 ，振荡、摇匀。 ③把3个培养瓶放在37度（或适宜温度）的恒温箱中培养。 （3）制作临时装片： ①当细胞增殖到大约8代左右时，同时从恒温箱中取出3个培养瓶，再一次用 液处理，然后加入动物细胞固定液，迅速杀死细胞并固定细胞分裂相。 ②静置一段时间后，分别从各培养瓶底部吸取适量的细胞悬浮液，滴在与培养瓶有相同编号的载玻片的中央，加2滴 进行染色，3—5min后，盖上盖玻片。 （4）镜检和统计： 把临时装片放在显微镜下，先用低倍镜观察，然后再用高倍镜，寻找处于有丝分裂 期的细胞，并与小白鼠正常细胞有丝分裂同一时期高倍显微照片进行对比，统计并计算该期变异的细胞占该细胞总数的百分数并做好记录（Q值）。 （5）结果分析与结论： ①在试验中，C培养瓶起 作用。 ②经研究人员试验得知，A、B、C三个培养瓶的Q值依次为：QA=1.3%,QB=12.5%。QC=0.01%，由此可得出该试验的结论是 。